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分子生物学服务

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详细介绍Detailed Introduction

CRISPR/Cas基因编辑载体
背景介绍
       在植物基因功能研究中,反向植物遗传学是经典的研究思路之一,通常从一个基因入手,通过过表达、干扰或基因编辑等手段调节一个或多个基因的表达水平,观察对应的表型变化,从而对相关基因进行一系列的分子功能研究。
       基因编辑技术主要是利用序列特异性核酸酶在特定基因位点产生DNA双链断裂,借助编辑受体自身的DNA修复系统在非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)过程中产生随机的Indels (Small insertions and deletions)或在同源重组修复过程中插入或替换相应的基因片段,最终实现基因组序列的突变。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)系统以及CRISPR/Cas(Clustered regu­larly interspaced short palindromic repeat-associated protein)系统,其中,CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点,成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。2020年,Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna两位科学家获得了诺贝尔化学奖,以表彰她们在“开发CRISPR/Cas基因组编辑方法”方面作出的贡献。

图 与野生型相比,nor-like基因的两个突变株系的果实成熟时间大大延迟(Gao et al.,2018)。

原理简介
       CRISPR/Cas系统分为两大类五种类型-),目前应用较广的CRISPR/Cas9系统为II型CRISPR系统,仅需一个Cas蛋白和两个RNA元件即可实现对靶DNA的切割。为了进一步简化CRISPR/Cas9系统,通过保留必需元件tracrRNA和crRNA的核心序列并引入连接区,将两者合并为一个sgRNA(Single guide RNA),并通过体外实验证实Cas9蛋白能在sgRNA的引导下切割双链DNA,这一系列成果为CRISPR/Cas9在基因编辑中的广泛应用奠定了坚实基础。自2013年起,利用CRISPR/Cas9技术相继实现了对人类细胞、小鼠细胞、斑马鱼、果蝇、水稻、拟南芥等真核系统中的内源基因组编辑。
       来源于链球菌Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白SpCas9最先被应用于基因编辑,该蛋白含有一个RuvC-like结构域和一个HNH核 酸酶结构域,两者分别在靶DNA的PAM序列“NGG”上游3nt处对DNA双链进行切割,形成平末端。在真核系统中,需要在Cas9蛋白中添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。sgRNA是一段具有特定结构的单链RNA,其5‘端约20个碱基与靶DNA互补配对结合,引导Cas9/sgRNA复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。因此,在构建基因编辑载体编辑受体基因组中不同的位点时,只须改变sgRNA中5’端的特异位点识别序列,而其他元件可保持不变。此外,通过构建多个sgRNA表达盒的串联载体,可实现同时对多个靶位点的有效编辑,显著地提高该系统的编辑效率。在基因编辑载体构建完成后,导入植物细胞的有效方法包括原生质体、PEG转染、农杆菌叶片注射法、基因枪轰击、农杆菌介导转化等,不同方法在不同植物中的编辑效率各异。在此基础上,不同实验室或机构针对植物系统影响编辑效率的关键因素,如sgRNA序列、启动子选择、Cas9变体或同源蛋白的选择等进行了一系列探索和优化。
       更多关于基因编辑系统的介绍,例如单碱基编辑系统(ABE、CBE)、先导编辑系统(PE)等请参考第八章“植物基因编辑”

我司载体介绍
       在植物体系中,我司目前主要使用自主研发并改造后的pCAMBIA系列载体(无知识产权归属问题,Cambia机构已开放给任何人使用的权利,详情请见网站 http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)。
         我司原始基因编辑载体为双元载体,并携带卡纳原核抗性和真核筛选标记(可选潮霉素、Basta或G418进行筛选)。我们可以针对您想要编辑的靶序列,分析序列的各项参数后设计引物,选择最合适的原始基因编辑载体,退火合成靶序列,再连入原始载体, 得到重组子后直接进行遗传转化实验。

我司部分原始基因编辑载体列表。可根据不同的需求,选择不同的启动子及真核抗性的载体。

适用场景
1、 功能基因的敲除;
2、 非编码区的编辑,例如对启动子、microRNA、lncRNA的基因序列进行编辑;
3、 单碱基编辑、精准碱基编辑;
4、 非同源/同源多基因敲除、代谢通路多基因敲除;
5、 大片段删除。

优势特点
1、 采用我司已被授权的国际PCT专利技术(专利号:US 10,144,936 B2)来进行sgRNA的片段组装及无缝组装,同时,对于单个、 多个sgRNA序列均可进行组装;
2、 载体资源丰富,根据您研究的物种、靶序列,均有对应经多次编辑效率测试后的最优原始载体骨架推荐,也可个性化订制您有其它需求的基因编辑载体;
3、 基因编辑载体库中有多种真核筛选标记(可选潮霉素、Basta或G418进行筛选)的原始载体可供选择,同时,多基因编辑、单碱基编辑、精准碱基编辑等特殊基因编辑系统也可满足您的特殊实验需求;
4、 载体均为双元载体,可直接应用于后期单子叶和双子叶遗传转化;
5、 可以与我司转基因服务、检测服务、蛋白服务等衔接,整个实验可以畅通且快速地完成。

实验流程
客户在线下单—订单/实验材料确认—CloneCAD实验设计—基因编辑载体构建—遗传转化—PCR鉴定阳性株系(后两步为可选项)

实验周期
5-7个工作日
 

客户下单及项目信息填写:
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称,选择项目类型[CRISPR/Cas基因组编辑载体]、项目所需要的具体信息,价格由系统自动计算。 
点击下单

实验信息
在实验开始、结题关键节点系统会自动发送短信到申请人手机进行告知,实验过程中客户可以随时登录客户管理系统査看项目实时进展情况。实验结题后,实验报告、检测结果可在线査看,并永久保留。实验过程用到的菌株、载体、受体材料免费为客户保存半年后销毁。

实验交付内容
1、 重组载体的全序列信息和注释信息;
2、 重组载体的酶切图谱;
3、 重组载体的测序结果;
4、 重组载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌)。

参考文献
Gao Y, Wei W, Zhao X, Tan X, Fan Z, Zhang Y, Jing Y, Meng L, Zhu B, Zhu H, Chen J, Jiang CZ, Grierson D, Luo Y, Fu DQ, 2018. A NAC transcription factor, NOR-likel, is a new positive regulator of tomato fruit ripening. Hortic Res. 5:75.


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