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分子生物学服务

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详细介绍Detailed Introduction

发夹干扰载体
背景介绍
       在植物基因功能研究中,反向植物遗传学是经典的研究思路之一,通常从一个基因入手,通过过表达、干扰或基因编辑等手段调节一个或多个基因的表达水平,观察对应的表型变化,从而对相关基因进行一系列的分子功能研究。
       RNA干扰(
RNA interference,RNAi)是指生物体内由双链RNA诱发的基因沉默现象,最早是在线虫中被发现的。在植物RNAi的研究中,无论是未知基因功能验证还是已知功能基因的表达调控,构建相应的RNAi表达载体都是最基本的实验步骤和必要方法。


图 使用发夹RNA载体干扰ap1基因会影响花的发育(Chuang & Meyerowitz, 2000)。

原理简介
       在RNAi研究中,通常通过向细胞内导入发夹RNA(hairpin RNA, hpRNA)来引起干扰,即在构建植物转基因的双元载体时,通过强启动子驱动一个“正向序列一环一互补序列”的转录单元进行转录,转录出的RNA可形成hpRNA, hpRNA通过DICER酶的作用,被加工成小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),这些siRNA与ARGONAUTE (AGO)等蛋白结合,形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),之后,siRNA与mRNA互补配对,RISC剪切、降解RNA分子,从而起到干扰基因表达的作用。


图 siRNA的干扰机制。


图 典型的hpRNA结构。

我司载体介绍
       在植物体系中,我司目前主要使用自主研发并改造后的pCAMBIA系列载体(无知识产权归属问题,Cambia机构已开放给任何人使用的权利,详情请见网站http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)。
       我司原始干扰载体中含有花椰菜花叶病毒35S启动子(35S promoter of Cauliflower Mosaic Virus, CaMV35S)或玉米Ubiquitin启动子来启动转录单元的转录,载体上携带卡纳原核抗性和真核筛选标记(可选潮霉素、Basta或G418进行筛选)。我们可以针对您的目的基因序列,评估序列的特异性后设计发夹序列,克隆互补的发夹片段,再按“正向序列-环-互补序列”连入原始载体骨架,得到重组子后进行遗传转化实验,从而抑制目的基因表达。

表. 我司原始发夹干扰载体列表。可根据不同的需求,选择不同的启动子或真核抗性的载体。

适用场景
       进行基因功能的研究,降低目标基因的表达水平。但需要注意,一般hpRNA引起的基因沉默会下调基因表达,不能彻底使其失活,如需使基因彻底失活,建议使用基因编辑的方法。


图 hpRNA应用领域

优势特点
1、采用我司已被授权的国际PCT专利技术(专利号:US 10,144,936 B2)来进行片段组装及无缝组装;
2、载体资源丰富,除了上述常用的CaMV35S、Ubi启动子外,我司也提供G10-90、rbcS、Per、GluB-4、 GluA-1等诱导型或特异性启动子的发夹干扰载体构建服务,也可个性化订制您有其它需求的载体;
3、载体库中有多种真核筛选标记(可选潮霉素、Basta或G418进行筛选)的原始载体可供选择;
4、载体均为双元载体,可直接应用于后期单子叶和双子叶遗传转化;
5、可以与我司转基因服务、检测服务、蛋白服务等衔接,整个实验可以畅通且快速地完成。

实验流程
客户在线下单—订单/实验材料确认—CloneCAD实验设计—
全基因合成、基因克隆或基因扩增— RNAi载体构建—遗传转化—PCR鉴定阳性株系(后两步为可选项)

实验周期
5-7个工作日

客户下单及项目信息填写:
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称,选择项目类型[植物基因干扰(RNAi)载体构建]、项目所需要的具体信息,价格由系统自动计算。 

实验信息
在实验开始、结题关键节点系统会自动发送短信到申请人手机进行告知,实验过程中客户可以随时登录客户管理系统査看项目实时进展情况。实验结题后,实验报告、检测结果可在线査看,并永久保留。实验过程用到的菌株、载体、受体材料免费为客户保存半年后销毁。

实验交付内容
1、 重组载体的全序列信息和注释信息;
2、 重组载体的酶切图谱;
3、 重组载体的测序结果;
4、 重组载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌)。

参考文献:
Chuang CF, Meyerowitz EM, 2000. Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 4985-90.


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