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分子生物学服务

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详细介绍Detailed Introduction

 启动子分析载体构建
背景介绍
       基因的表达调控是一个多阶段、多层次的复杂过程,简单的可以分为转录前、转录、转录后、翻译、翻译后这五个水平,其中转录水平上的调控是很关键的一环。启动子是位于基因5’端上游的DNA序列,能指导RNA聚合酶与DNA的正确结合、活化RNA聚合酶、募集相应的转录因子形成特异性转录起始复合体等,进而决定转录的方向和效率,是基因表达调控的重要顺式元件,因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于理解基因功能有重要的作用。
       启动子的表达模式及强度只能通过报告基因来检测,目前在植物启动子的研究中常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、绿色荧光蛋白基因(GFP)及其衍生出来的其他荧光蛋白、荧光素酶基因(LUC)等。
GUS作为报告基因分析启动子在不同组织的表达模式(Qin etal., 2011)。


GFP作为报告基因分析启动子在刀豆根瘤菌中的表达模式(b、f)(Liu etal., 2020)。
原理简介
       使用“启动子-报告基因-终止子”的载体构建方式,适用的转化系统有原生质体转化系统、基因枪轰击或农杆菌介导的瞬时表达系统以及转基因植物的稳定表达系统等。最常用的是以GUS作为报告基因来进行启动子分析实验。GUS基因表达的产物为β-葡萄糖昔酸酶,属水解酶类,在适宜的条件下,该酶可将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)水解生成蓝色产物。将目标基因的启动子与GUS报告基因相连,根据植物组织染色的结果可判断启动子表达的时空性和表达强度。
       以GFP或其他荧光蛋白作为报告基因来进行启动子分析实验,在一定波长的光的激发下可以发出特定颜色的荧光,使用起来非常方便。

我司载体介绍
        我司原始启动子分析载体中含有promoter::GUS::terminator、promoter::荧光蛋白::terminator
的转录单元,载体上携带卡那抗性和真核筛选标记(可选潮霉素、Basta、G418或甘露糖进行筛选),可直接用于后续不同的转化系统例如原生质体转化系统、基因枪轰击或农杆菌介导的瞬时表达系统以及转基因植物的稳定表达系统及检测。
       我们可以针对您的启动子序列,设计引物后扩增预期片段,连入原始载体骨架,得到重组子后进行瞬时表达或稳定遗传转化实验。

表 我司原始启动子分析载体列表。可根据不同的需求,选择不同真核抗性的载体。


表 我司原始启动子分析载体列表。可根据不同的需求,选择不同的荧光蛋白及真核抗性的载体。


图 原始启动子分析载体pBWA(V)H-gus,GUS基因5’端留有酶切位点,可连入目的基因的启动子。

图 重组后的启动子分析载体pBWA(V)HP-gus,GUS基因5’端的酶切位点被无缝替换成了目的基因的启动子。

图 原始启动子分析载体pBWA(V)H-gfp,GFP基因前留有酶切位点,可连入目的基因的启动子。

图 重组后的启动子分析载体pBWA(V)HP-gfp,两个酶切位点被无缝替换成了目的基因的启动子。

适用场景
1、分析基因的启动子表达的时空性和表达强度;
2、通过组织化学染色来做启动子活性的定性分析,还可以做启动子活性的定量检测;
3、鉴定启动子的顺式作用元件。

优势特点
1、采用我司已被授权的国际PCT专利技术(专利号:US 10,144,936 B2)来进行启动子分析载体的构建,且该组装为无缝组装;
2、载体库中有多种真核筛选标记(可选潮霉素、Basta、G418或甘露糖进行筛选)的原始载体可供选择;
3、  载体均为双元载体,可直接用于后续不同的转化系统例如瞬时转化系统或稳定转化系统;
4、可以与我司转基因服务、检测服务、蛋白服务等衔接,整个实验可以畅通且快速地完成。

实验流程
客户在线下单—订单/实验材料确认—CloneCAD实验设计—启动子克隆或全基因合成—启动子分析载体构建—遗传转化—PCR鉴定阳性株系(后两步可选)

实验周期
约5-7个工作日

客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、项目所需要的具体信息,价格由系统自动计算。      

实验信息
在实验开始、结题关键节点系统会自动发送短信到申请人手机进行告知,实验过程中客户可以随时登录客户管理系统査看项目实时进展情况。实验结题后,实验报告、检测结果可在线査看,并永久保留。实验过程用到的菌株、载体、受体材料免费为客户保存半年后销毁。

实验交付内容
1、重组载体的全序列信息和注释信息;
2、重组载体的酶切图谱;
3、重组载体的测序结果;
4、重组载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌)。

参考文献
Qin BX, Tang D, Huang J, et al., 2011. Rice OsGLl-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane. Mol Plant 4, 985-95.
Liu S, Liao LL, Nie MM, et al., 2020. A VIT-like transporter facilitates iron transport into nodule symbiosomes for nitrogen fixation in soybean.New Phytol 226, 1413-28.


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