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蛋白相关服务

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详细介绍Detailed Introduction

酵母建库及筛库

原理简介
       提到酵母文库不得不提到酵母双杂。酵母转录因子GAL4包含有两个彼此作用但是空间上分离的结构域。一个是DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD),另一个则是转录激活结构域(Activating domain,AD)。当两个结构域充分接近的时候则呈现完整的GAL4转录因子活性,并可以激活下游的报告基因。因此可以将想要研究的两个蛋白分别连在含有AD与BD的载体上,之后转染酵母。如果这两个蛋白相互作用,则会使AD和BD在空间上相遇,从而激活下游的报告基因。但这种方法只能研究两个特定蛋白的相互作用。
       为了研究某种蛋白与哪些蛋白有相互作用,酵母文库就诞生了。所谓的“库”,顾名思义就是“仓库”,也就是包含所有基因的一个大仓库。我们通过提取被研究物种的总RNA,再分离出mRNA,通过逆转录得到cDNA,之后我们将这些cDNA与AD载体连接,得到了一个AD文库,再将其转入酵母中,理论上,这样的酵母库能够表达被研究物种的所有蛋白。

文库构建方法
       我司目前主要使用Gateway技术进行酵母文库构建。其原理如下:

 

实验流程
1、客户样品QC,total RNA提取(也可由客户直接提供total RNA)
2、利用磁珠分选进行mRNA分离
3、以mRNA为模板使用进行第一链cDNA合成
4、第二链cDNA合成
5、三框接头连接
6、使用磁珠分选进行cDNA分级分离高效去除小片段
7、BP重组构建初级文库并电转化DH10B大肠杆菌
8、初级文库质量检测
9、LR重组构建次级文库并电转化DH10B大肠杆菌
10、次级文库质量检测

 
相关实验结果案例展示
1、 total RNA提取结果:

2、 mRNA纯化

3、 初级文库片段长度与阳性率验证
初级文库:长度范围300-3000bp,平均长度>1200bp
,阳性率100%

4、次级文库片段长度与阳性率验证
次级文库:长度范围:650-3000bp,平均长度>1200bp,阳性率100%


 

项目周期
35个工作日

质量标准
1、原始文库容量大于6*10^6 CFU
2、平均插入片段大于1200 bp
3、克隆阳性率大于95%
                 

酵母文库交付结果
1、大肠杆菌次级文库甘油菌 1 mL/管 * 1管
2、次级文库质粒500 μg
3、文库构建相关原始图片
4、文库构建实验报告

 

材料要求
针对每个文库,客户需提供至少能提取500 μg总RNA的新鲜样本,或者至少500 μg的高质量总RNA。具体要求如下:

酵母建库技术服务样品接收标准


 
客户下单及项目信息填写
1.客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行提交;
2.提交项目所需要的具体信息,包括:
(1)已知的材料品种与组织信息;
(2)文库构建类型(核文库/膜文库);
(3)如果有特殊要求请在备注中注明
3.文库构建材料:用于提取total RNA的组织材料或者已提取好的total RNA;
酵母文库构建点击下单

酵母文库筛库点击下单

实验信息 
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时90系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看地址。实验结题后,实验报告,检测结果可在线查看或打印,并永久保留。


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