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蛋白相关服务

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详细介绍Detailed Introduction

酵母建库及筛库
原理简介
       提到酵母文库不得不提到酵母双杂。酵母转录因子GAL4包含有两个彼此作用但是空间上分离的结构域。一个是DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD),另一个则是转录激活结构域(Activating domain,AD)。当两个结构域充分接近的时候则呈现完整的GAL4转录因子活性,并可以激活下游的报告基因。因此可以将想要研究的两个蛋白分别连在含有AD与BD的载体上,之后转染酵母。如果这两个蛋白相互作用,则会使AD和BD在空间上相遇,从而激活下游的报告基因。但这种方法只能研究两个特定蛋白的相互作用。
       为了研究某种蛋白与哪些蛋白有相互作用,酵母文库就诞生了。所谓的“库”,顾名思义就是“仓库”,也就是包含所有基因的一个大仓库。我们通过提取被研究物种的总RNA,再分离出mRNA,通过逆转录得到cDNA,之后我们将这些cDNA与AD载体连接,得到了一个AD文库,再将其转入酵母中,理论上,这样的酵母库能够表达被研究物种的所有蛋白。

文库构建策略比较

建库实验流程
1、客户样品质控,Total RNA提取(也可由客户直接提供Total RNA);
2、利用磁珠分选进行mRNA分离;
3、以mRNA为模板使用Clontech的SMART技术合成cDNA;
4、使用磁珠分选进行cDNA分级分离高效去除小片段;
5、将分级纯化的cDNA与pGADT7线性化载体进行同源重组;
6、重组产物纯化后电转化DH10B感受态并涂布平板;
7、cDNA文库质量验证;
8、文库质粒提取;
9、文库质粒转化酵母Y187(可选)。

 
酵母单杂交文库筛选实验流程
1、诱饵载体的构建;
2、诱饵质粒的自激活检测;
3、文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞;
4、文库筛选和3-AT优化;
5、文库筛选结果测序分析;
6、筛选结果回转验证;
7、详细报告的整理和数据发送。

酵母双杂交文库筛选实验流程
1、诱饵载体与菌株构建;
2、诱饵质粒进行毒性及自激活检测;
3、pGBKT7-Bait/Y2H Gold与酵母文库接合(mating);
4、文库筛选与3-AT优化;
5、酵母文库筛选及结果测序分析;
6、筛选结果回转验证。

相关实验结果案例展示
                 

实验周期
180个工作日

质量标准
1、原始文库容量大于10^7 CFU
2、平均插入片段大于1200 bp
3、克隆阳性率大于95% 

材料要求

酵母建库技术服务样品接收标准


 
客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式,提交项目所需要的具体信息,包括:
1、已知的材料与组织信息;
2、尽可能丰富的相关资料、文献;
3、材料信息:用于提取Total RNA的组织材料或者已提取好的Total RNA的标识名。

实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

酵母单杂文库交付内容

酵母双杂文库交付内容

 


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