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详细介绍Detailed Introduction

双荧光素酶报告基因检测实验
原理简介
        荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。目前,以北美萤火虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛。
       利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性,把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,经适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

为什么采用双荧光素酶报告系统?
       单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响,而双报告基因则通过共转染的“对照”为实验提供一基准线,从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响,使得数据结果更为可信。一般情况下,海肾荧光素酶基因作为内参使用,将两个报告基因构建到同一个质粒上,分别用不同的启动子启动其表达。这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响,相当于做了标准化,使测试结果不受实验条件变化的干扰。计算结果时,将萤火虫荧光素酶的检测值除以海肾荧光素酶检测值(Firefly luciferase/Renilla luciferase)即可。

双荧光素酶报告基因检测实验的优点
1、灵敏度高,比Western blot灵敏度高1000倍以上;
2、植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达;
3、荧光素酶检测不受细胞内其它物质影响;
4、检测方便;
5、检测范围广,大于7个数量级。

适用场景
1、验证microRNA同mRNA靶向互作:将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该microRNA,如果荧光素酶活性下降,则提示为其靶序列。

 
2、验证microRNA同lncRNA靶向互作:将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc 3’UTR区域,检测萤光素活性。
3、启动子结构分析:将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入荧光素酶报告载体,检测其启动子活性。
 4、启动子SNP分析:一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
5、验证特定转录因子同其调控序列的作用:将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转其转录因子,可分析转录因子是否提高萤光素酶活性。
6、验证启动子活性:将待测启动子构建至荧光素酶基因的上游,检测启动子的活性。

实验流程
客户在线下单—订单/实验材料确认—重组质粒制备—材料选择—转化/染—裂解细胞—荧光检测—数据分析

实验周期
2周

样品接收标准

客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式,提交项目所需要的具体信息,包括:
1、双荧光素酶报告基因所需的质粒与序列相关信息;
2、尽可能丰富的相关资料、文献。
转录激活分析点击下单
双荧光素启动子分析点击下单
miRNA-mRNA相互作用点击下单

实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

实验交付内容
1、重组载体的全序列信息和注释信息;
2、重组载体的酶切图谱;
3、重组载体的测序结果;
4、重组载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌);
5、双荧光素酶的荧光比值。


 


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