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蛋白相关服务

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详细介绍Detailed Introduction

拉下实验(Pull-down assay)

原理简介
       拉下实验(Pull-down assay)是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外实验技术,近年来越来越受到广大研究者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。

适用场景
1、用于验证两个已知蛋白的相互作用;
2、筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
 

图 Pull-down验证蛋白互作原理图

实验流程
GST/His-诱饵蛋白原核表达载体构建—原核表达—蛋白纯化—Pull-down捕获猎物蛋白—SDS-PAGE电泳—Western blot或LC-MS/MS

实验周期
 

拉下实验(Pull-down)的优点
1、鉴定的蛋白是直接作用的蛋白,非间接作用的复合体;
2、GST标记可把一些难溶蛋白变成可溶蛋白,使实验变得更易操作;
3、GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强,洗脱纯度高。

拉下实验(Pull-down)的缺点
1、两个非同一定位的蛋白可能因电荷或是强亲和力的原因造成假阳性,需用其他方法再次验证,例如Co-IP等;
2、验证互作是在试管中进行的生化反应,不能够完全反映细胞内蛋白真实互作的状态;
3、融合表达的GST标签,肽链较长,可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

客户下单及项目信息填写
在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录,请客户按照页面提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式,提交项目所需要的具体信息:
1、探针基因和靶基因相关序列信息;
2、样品种属及类型;
3、如需进行特异性WB检测,客户需要提供特异性一抗;
4、尽可能丰富的相关资料、文献。

实验信息
实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看网址。实验结题后,实验报告、检测结果可在线查看或打印,并永久保留。

交付结果
1、载体:一份质粒、一份大肠杆菌菌液(25%甘油菌);
2、载体的测序结果;
3、实验报告。


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